Með stofnun Þjóðleikhússins náði leikhúsfólk loks því langþráða marki að hefja íslenska leiklist á atvinnustig. Fyrstu leikararnir voru fastráðnir að leikhúsinu frá 1. nóvember 1949; það voru þau Arndís Björnsdóttir, Indriði Waage, Haraldur Björnsson, Gestur Pálsson, Regína Þórðardóttir, Herdís Þorvaldsdóttir, Hildur Kalman, Inga Þórðardóttir, Jón Aðils, Lárus Pálsson, Róbert Arnfinnsson, Valur Gíslason, Þóra Borg og Ævar R. Kvaran. Aðrir helstu starfsmenn voru Lárus Ingólfsson leiktjaldamálari, Yngvi Þorkelsson leiksviðsstjóri, Hallgrímur Bachmann ljósameistari, Nanna Magnússon forstöðukona saumastofu og Lárus Sigurbjörnsson bókavörður; hann gerði raunar stuttan stans í leikhúsinu og sagði skilið við það sökum ágreinings við þjóðleikhússtjóra tveimur árum síðar. Fyrsti formaður þjóðleikhúsráðs var Vilhjálmur Þ. Gíslason og sat á þeim pósti til 1978.
Í samanburði við Leikfélag Reykjavíkur var Þjóðleikhúsið að sjálfsögðu gríðarlega umfangsmikil stofnun. Í grein, sem Guðlaugur Rósinkranz, fyrsti þjóðleikhússtjórinn, ritaði í fimm ára afmælisrit leikhússins kemur fram að um 70 manns starfi þá að staðaldri við það, þótt ekki séu allir á fullum launum, s.s. fatagæslukonur og dyraverðir. Samtals vinni árlega um 300 manns við leikhúsið að meira eða minna leyti. Nýjar sýningar fylltu oftast tuginn á hverjum vetri og stundum gott betur, auk þess sem erlendir gestaleikir voru nánast árlegur viðburður. Hér var því orðin gjörbylting í íslensku leikhúslífi sem hlaut að kosta mikil átök.
Þjóðleikhúsið var opnað formlega á sumardaginn fyrsta, 20. apríl, og var fyrsta sýningin Nýársnóttin eftir Indriða Einarsson undir leikstjórn Indriða Waage. Næsta kvöld var Fjalla-Eyvindur Jóhanns Sigurjónssonar frumsýndur undir stjórn Haralds Björnssonar og þriðja kvöldið Íslandsklukka Halldórs Laxness undir stjórn Lárusar Pálssonar. Vakti Íslandsklukkan langmesta hrifningu þessara leikrita og var sýnd við gríðarlegar vinsældir allt fram á árið 1952. Mikil aðsókn var að leikhúsinu fyrstu árin og varð hún hæst leikárið 1952-53, rúmlega 109.000 manns.
Á fyrstu árum og áratugum Þjóðleikhússins fór margvíslega starfsemi fram á vegum þess auk venjubundins sjónleikahalds. Leikhúsið rak leiklistarskóla frá upphafi, það sýndi óperur og balletta og stóð fyrir leikferðum út á land með valdar sýningar. Ein af helstu stoðum söngleika- og óperuhaldsins varð Þjóðleikhúskórinn, 40 manna kór sem var stofnaður árið 1953, undir stjórn dr. Victors Urbancic sem var einnig tónlistarstjóri hússins. Þá var Listdansskóli Þjóðleikhússins stofnaður árið 1952 og ráðinn sérstakur balletmeistari. Fyrsta leikför Þjóðleikhússins var farin til Akureyrar árið 1952 með sýningu leikhússins á Brúðuheimili Ibsens undir stjórn norsku stórleikkonunnar Toru Seglecke sem lék einnig aðalhlutverkið.
Fyrstu erlendu gestina bar að garði þegar í júní 1950, þegar Stokkhólmsóperan kom með sýningu sína á Brúðkaupi Fígarós Mozarts. Næsta vetur lék Anna Borg burðarhlutverk í tveimur sýningum, Heilagri Jóhönnu Bernard Shaws og Ímyndunarveiki Moliéres, og árið 1952 kom Kgl. leikhúsið í Kaupmannahöfn með leik Holbergs, Det lykkelige Skibbrud. Þá komu hingað erlendir leikstjórar, s.s. Simon Edvardsen frá Kgl. óperunni í Stokkhólmi sem setti á svið fyrstu óperu- og óperettusýningar leikhússins, auk barnaleiksins Ferðina til tunglsins. Einnig tóku erlendir söngvarar oftast þátt í óperusýningunum, með misgóðum árangri að sumra sögn og við mismikla hrifningu innlendra söngvara.
Aðalleikstjórar leikhússins fyrstu árin voru þeir Indriði Waage, Haraldur Björnsson og Lárus Pálsson. Í kringum 1960 kom hins vegar ný kynslóð fram á sjónarsviðið, þó að Lárus starfaði áfram um hríð, en hann lést langt fyrir aldur fram árið 1968. Helstu fulltrúar hinnar nýju kynslóðar voru þeir Benedikt Árnason, Baldvin Halldórsson, Einar Pálsson, Gunnar Eyjólfsson og Klemenz Jónsson. Þegar komið var fram á sjöunda áratuginn urðu þeir Benedikt og Baldvin aðalleikstjórar hússins, en Klemenz Jónsson annaðist barnaleikritin. Guðlaugur Rósinkranz var ekki leikhúsmenntaður maður, ráðning hans var almennt talinn pólitísk og stjórn hans á leikhúsinu löngum umdeild. Hann gat verið seinheppinn í orðum og framkomu og varð snemma þakklátur skotspónn háðfugla, bæði innan og utan leikhússins. Verkefnavalið sætti mikilli gagnrýni fyrstu árin, ekki síst valið á íslensku leikritunum. Tilraunir til að endurvekja vinsæl verk og sýningar neðan úr Iðnó þóttu oftar en ekki mistakast og leikhúsinu lánaðist ekki að leggja grunn að þeirri endurreisn íslenskrar leikritunar sem allir vonuðust eftir. En Guðlaugur hafði engu að síður sína kosti; hann var dugmikill og ósérhlífinn, stóð utan við klíkur og bandalög leikhússlífsins og sýndi iðulega og sannaði að hann lét engin "stórveldi" þess segja sér fyrir verkum. Aðstaða hans var ekki auðveld; hann þurfti að byggja hér upp fjölþætta leikhússtofnun nánast frá grunni í samvinnu við fólk sem ekki bar allt mikla virðingu fyrir hæfileikum hans og taldi sig vita mun betur en hann hvernig leikhúsinu yrði best stýrt. Guðlaugur lét slíkt þó ekki á sig fá; hann var maður laus við langrækni og þannig skapi farinn að honum gat lynt við flesta. Ef því var að skipta gat hann sýnt dirfsku og er oft vitnað til þeirrar ákvörðunar hans að taka söngleikinn My fair Lady til sýninga, þó að flestir teldu það hið mesta óráð. En leikhússtjórinn hafði sitt fram og sýningin varð einn mesti sigur leikhússins í hans tíð. Undir stjórn Guðlaugs Rósinkranz og þeirra leikstjóra, sem hann ákvað að tefla fram, tók leikendahópurinn góðum framförum, enda höfðu þeir ungu leikarar, sem réðust til hússins á upphafsárum þess, átt þess kost að kynna sér leiklist meðal stórþjóðanna og afla sér bestu menntunar. Á árunum í kringum 1960 og fram eftir sjöunda áratugnum má benda á ýmsar ágætar sýningar þar, s.s. verk Arthurs Miller, Horfðu reiður um öxl John Osbornes, Nashyrninga Ionescos, Kardimommubæ Egners, Húsvörð Harolds Pinter, Gísl Brendan Behans og söngleiki á borð við My fair lady og Járnhaus bræðranna Jóns Múla og Jónasar Árnasonar. Engu að síður þótti mörgu ungu leikhúsfólki verkefnaval og listræn stefna Þjóðleikhússins hvorki frumleg né framsækin, sem átti hvað mestan þátt í því að það sameinaðist um stofnun tilraunaleikhússins Grímu árið 1961. Það setti Þjóðleikhúsinu að sjálfsögðu verulegar skorður að það réði fyrstu fjórtán árin aðeins yfir stóra sviðinu einu, þó að raddir um minna svið, jafnvel tilraunasvið, yrðu snemma háværar. Leikhússtjórnin brást alltof seint við slíkum kröfum og litla sviðið í Lindabæ, sem var opnað árið 1964, varð aldrei sá vettvangur nýsköpunar sem menn vildu sjá, enda Gríma þá komin til sögunnar og starfaði með miklum krafti allan þann áratug. Þá var L.R. einnig gengið í endurnýjun lífdaganna og veitti Þjóðleikhúsinu harða samkeppni sem segja má að hafi verið eitt helsta hreyfiafl íslensks leikhúslífs frá 1950, allt þar til frjálsu leikhóparnir/sjálfstæðu leikhúsinu tóku að eflast um og upp úr 1990.
Þjóðleikhússtjórar hafa verið fimm til þessa dags. Eftir að Guðlaugur Rósinkranz lét af störfum árið 1972 tók Sveinn Einarsson við og sat til 1983, Gísli Alfreðsson 1983-1991, Stefán Baldursson 1991-2005 og Tinna Gunnlaugsdóttir frá 2005.